Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Для приготовления всех буферных растворов и реактивов, применяемых в данном методе, используют воду дистиллированную Р.
Исследуемый раствор. Достаточное количество исследуемого вещества, растворяют в растворе 9 г/л натрия хлорида Р для получения раствора с концентрацией в пределах концентраций стандартных растворов.
Стандартные растворы. В растворе (9 г/л) натрия хлорида Р растворяют стандартное вещество для исследуемого белка. Пропорционально разводят этот раствор в растворе 9 г/л натрия хлорида Р для получения не менее трех растворов сравнения с концентрацией белка, равномерно распределенной в интервале 0,5 мг/мл - 10 мг/мл.
Контрольный раствор. Используют раствор 9 г/л натрия хлорида Р.
Биуретовый реактив. Растворяют 3,46 г меди сульфата Р в 10 мл горячей воды дистиллированной и охлаждают (Раствор A). Растворяют 34,6 г натрия цитрата Р и 20,0 г натрия карбоната безводного Р в 80 мл горячей воды дистиллированной Р и охлаждают (Раствор B). Смешивают растворы А и B и доводят объем водой дистиллированной Р до 200 мл. Используют раствор в течение 6 месяцев. В случае помутнения или выпадения осадка, реактив не подлежит использованию.
Методика. К одному объему исследуемого раствора прибавляют равный объем раствора 60 г/л натрия гидроксида Р и перемешивают. Немедленно добавляют биуретовый реактив в количестве равном 0,4 объема исследуемого раствора и быстро смешивают. Выдерживают при комнатной температуре не менее 15 мин. Через 90 мин после добавления биуретового реактива определяют оптическую плотность (2.2.25) растворов сравнения и исследуемого раствора при длине волны 545 нм, используя в качестве раствора сравнения контрольный раствор. Мутные растворы или растворы с осадком не пригодны для расчета концентрации белка.
Расчеты. Зависимость оптической плотности от концентрации белка имеет приблизительно линейный характер в рамках указанного интервала концентрации белка для стандартных растворов. Строят график зависимости оптических плотностей стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для формирования стандартного графика. Рассчитывают коэффициент корреляции для стандартного графика. Система считается пригодной, если линейная зависимость имеет коэффициент не менее 0,99. На основании стандартного графика и оптической плотности исследуемого раствора определяют концентрацию белка в исследуемом растворе.
Интерферирующие вещества. Для минимизации эффекта интерферирующих веществ белок может быть преципитирован из исследуемой пробы следующим образом: добавляют 0,1 объема раствора 500 г/л кислоты трихлоруксусной Р к 1 объему раствора исследуемого образца, удаляют всплывающий слой и разводят преципитат в небольшом объеме 0,5 М раствора натрия гидроксида Р. Используют полученный раствор для приготовления исследуемого раствора.
МЕТОД 6
Данный флюориметрический метод основан на дериватизации белка o-фталальдегидом, который в первую очередь взаимодействует с аминами белка (N-терминальная аминокислота и є-аминогруппа лизиновых остатков). Чувствительность анализа может быть повышена гидролизом белка перед добавлением o-фталальдегида. Гидролиз делает а-аминогруппу аминокислот, входящих в структуру белка, доступной для реакции с фталальдегидным реактивом.
Данный метод требует минимального содержания белка. Первичные амины как, например, трис(гидроксиметил)аминометан и аминокислотные буферные растворы взаимодействуют с фталальдегидом, вследствие чего их следует удалять. Аммоний при высоких концентрациях взаимодействует с фталальдегидом. Флюоресценция, полученная при взаимодействии амина с фталальдегидом, может быть нестабильной. Использование автоматизированных процедур для стандартизации данного метода может повысить качество и точность данного метода.
Для приготовления всех буферных растворов и реагентов, применяемых в данном методе, используют воду дистиллированную Р.
Исследуемый раствор. Растворяют достаточное количество исследуемого вещества, в растворе 9 г/л натрия хлорида Р для получения раствора с концентрацией в пределах концентраций стандартных растворов. Перед добавлением фталалдегидного реактива устанавливают pH раствора от 8 до 10,5.
Стандартные растворы. Стандартное вещество исследуемого белка, растворяют в растворе 9 г/л натрия хлорида Р. Пропорционально разводят этот раствор в растворе 9 г/л натрия хлорида Р для получения не менее пяти растворов сравнения с концентрацией белка, равномерно распределенной в интервале 10 мкг/мл-200 мкг/мл. Перед добавлением фталалдегидного реактива устанавливают pH раствора от 8 до 10,5.
Контрольный раствор. Используют раствор 9 г/л натрия хлорида Р.
Боратный буферный раствор. Растворяют 61,83 г кислоты борной Р в воде дистиллированнойР и устанавливают pH 10,4 при помощи раствора калия гидроокиси Р. Доводят раствор до 1000 мл водой дистиллированной Р и перемешивают его.
Фталальдегидный основной раствор. Растворяют 1,20 г фталальдегида Р в
1,5 мл метанола Р, добавляют 100 мл боратного буферного раствора и перемешивают. Добавляют 0,6 мл раствора 300 г/л макрогол 23 лаурилового эфира Р и перемешивают. Хранят при комнатной температуре и используют в течение 3-х недель.
